mfuzz官网听说WGCNA官网崩了？那还能做基因共表达分析吗？

　　在开始进行任何分析之前，我会首先尝试理解实验设计。对实验设计有良好的理解有助于我决定如何分析和可视化数据。

　　根据metadata数据，有16个发育阶段。根据论文，发育阶段的顺序是：这里的数据比文章中的多一些，后面可以筛选一下数据

　　这是一个双因素实验设计：发育阶段 * 组织。主要的变异来源是发育阶段、组织和重复样本。我通常会制作一个汇总表来指导我的下游分析：

　　现在我们了解了实验设计，接下来我们将确定实验中变异的主要驱动因素。换句话说，在发育阶段和组织之间，哪个因素对实验中的变异贡献更大？这个问题的答案对于我们如何最有效地可视化数据至关重要。

　　结果如下：根据论文，5个果皮组织是通过激光捕获显微切割（LM）收集的。首先需要注意的是技术差异。看来解剖方法确实是变异的主要来源，与PC1完全对应。

　　现在x轴（PC2）明显区分了发育阶段：从左到右，从年轻到老年。y轴（PC3）明显区分了种子和所有其他东西。

　　因此，在变异贡献方面，解剖方法 阶段 组织。我们将使用这些信息来指导下游的可视化。为了最好地区分生物学变异和技术变异，我们应该对手收集和LM样本进行单独的基因共表达分析。

　　这不是一个必须的操作，只因为我们对组织-阶段组合之间的生物学变异感兴趣，而对同一处理中复制品之间的噪声不太感兴趣。（有点类似于mfuzz的时间序列分析）

　　下一步是将每个基因与所有其他基因进行相关性分析。相关性的数量会随着基因数量的平方而增加。为了加速，我们可以选择只有高变异基因。背后的理念是，如果一个基因在所有样本中表达水平相似，那么它不太可能特别参与某个特定阶段或组织的生物学过程。

　　选择高变异基因有多种方法和多个截止值。例如，你可以计算所有基因的logTPM的基因级方差，并取上三分位数。你可以选择在所有组织中具有一定表达水平的基因（比如说 5 tpm），然后取高变异基因。这些都是任意的。

　　本次示例中，我们只取方差最高的5000个基因作为一个快速练习。在实际分析中需要包含更多的基因，但是相关性分析中的基因越多，速度就会越慢。

　　检查分析中是否包含了足够多的基因，一个好方法是查看诱饵基因是否在方差最高的基因之中。前面找的两个诱饵基因为PG 、PSY1，都在数据中。

　　现在我们可以将每个基因与所有其他基因进行相关性分析。这个工作流程的本质是简单的，如果你愿意，你可以使用更复杂的方法，比如GENIE3。

　　并不是所有的相关性都是统计上显著的，也不是所有的相关性在生物学上都是有意义的。我们如何选择在下游分析中使用哪些相关性。我将这一步称为“边的选择”，其中每个基因是一个节点，每个相关性是一条边。我有两种方法可以做到这一点。

　　随机抽取了20k条边并绘制了一个直方图。也可以绘制整个边表，当你抽样足够大时，它不会改变分布的形状。看起来在 r0.7（红线）时，分布迅速减少。因此，使用 r0.7r作为截止值。

　　使用Leiden算法来检测模块，这是一种基于图的聚类方法。Leiden方法产生的聚类中，成员之间高度相互连接。在基因共表达的术语中，它寻找彼此高度相关的基因组。

　　分辨率参数（resolution_parameter）控制你将获得多少个聚类。它的值越大，得到的聚类就越多。

　　还可以通过折线图来对聚类进行质量控制（QC）。如果绘制所有模块的图，那会太多，所以我们只选择2个模块来查看。

　　怎么说呢，感觉我个人不是很喜欢大篇幅使用tidyverse的代码，如果可以，我还是想用WGCNA吧！哈哈哈哈哈哈或。

　　针对手把手10分文章WGCNA复现：小胶质细胞亚群在脑发育时髓鞘形成的作用，里面的数据集进行wgcna以及我们的提到的Simple Tidy GeneCoEx分析，然后对比这两个模块算法的结果的一致性。这些样本进行了RNASeq测序，数据在GEO可供下载：。当然我偷了个懒，该文章Supplemental material提供了整理之后的csv矩阵，大概1万3千个基因。